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Article introduction

 

 

Transgenic monkey model of the polyglutamine diseases recapitulating progressive neurological symptoms”

Ikuo Tomioka, Hidetoshi Ishibashi, Eiko N. Minakawa, Hideyuki H. Motohashi, Osamu Takayama, Yuko Saito, H. Akiko Popiel, Sandra Puentes, Kensuke Owari, Terumi Nakatani, Naotake Nogami, Kazuhiro Yamamoto, Satoru Noguchi, Takahiro Yonekawa, Yoko Tanaka, Naoko Fujita, Hikaru Suzuki, Hisae Kikuchi, Shu Aizawa, Seiichi Nagano, Daisuke Yamada, Ichizo Nishino, Noritaka Ichinohe, Keiji Wada, Shinichi Kohsaka, Yoshitaka Nagai, Kazuhiko Seki
 掲載誌: eNeuro DOI: 10.1523/ENEURO.0250-16.2017

 

<研究の背景>
 神経変性疾患とは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ポリグルタミン病(家族性脊髄小脳変性症を含む)などの疾患の総称で、脳や脊髄にある神経細胞のうち、ある特定の領域の神経細胞が徐々に脱落する病気です。日本国内だけでも400万人以上の患者さんがいると推定されており、高齢化社会の進行に伴って患者さんの数が増えています。もの忘れ・手足のふるえや動かしづらさ・歩行時のふらつきなど、個々の疾患に特有の症状が出現し、徐々に進行しますが、その原因にはいまだ不明な点が多く、疾患の進行を止める根本的な治療法は確立されていません。
 ヒトの疾患に対する新たな治療法や診断法を開発するためには、ヒトの病態を再現した疾患モデル動物を用いて得られた基礎研究の成果をヒトにおける臨床研究へと展開する、いわゆるトランスレーショナル・リサーチ(橋渡し研究)が必須です。神経変性疾患においても、これまでに、齧歯類(ラットやマウスなど)のモデル動物を用いた基礎研究の成果をもとに、数多くの臨床研究が試みられています。しかしながら、基礎研究で効果が確認された治療薬の候補がヒトにおいては効果が乏しいなど、基礎研究から臨床研究への橋渡し研究の多くが成功に至っていないのが現状です。
 その大きな原因として、齧歯類の脳の構造や機能にはヒトとは異なる点が多いこと、また、薬剤などの効果や副作用も齧歯類とヒトとでは大きく異なることが挙げられます。より効果的に橋渡し研究を推進するため、すなわち、基礎研究で得られた成果を確実に臨床研究へつなげ、新しい治療法を開発するためには、脳の構造や機能、薬剤などの代謝経路がヒトに近似している霊長類を用いて、神経変性疾患のモデル動物を確立することが必要です。
 そこで、NCNPは小型霊長類であるコモンマーモセット(Callithrix jacchus、図1)に注目しました。実験動物として用いられる霊長類には、他にもマカクサル等がありますが、コモンマーモセットは霊長類の中では珍しく多産で、性成熟までの期間や妊娠期間、出産間隔が短いため、マカク類と比較して繁殖効率がよいこと、また、比較的小型(3-400 g)であることから、橋渡し研究に必要な個体数を確保しやすいのが特徴です。さらに、高次脳機能を司る前頭葉の割合がヒト同様に大きく、高い社会性を持っています。また齧歯類よりも脳が大きいことから、ヒトで用いられる頭部MRIなどの画像診断法を用いて脳を解析することが可能です。このようにコモンマーモセットは、多くの観点で齧歯類やマカクサルよりもヒトのモデルに適した特徴を持っており、様々な研究に応用される可能性を秘めています。わが国では、コモンマーモセットを用いた遺伝子改変動物作製技術が世界に先がけて確立されました。NCNPではこの技術を応用し、ポリグルタミン病の遺伝子改変モデルマーモセット系統の確立に世界で初めて成功しました。   
 

<研究の内容1:遺伝子改変コモンマーモセットの作出に成功>
 ポリグルタミン病は、いくつかの家族性脊髄小脳変性症(SCA1、SCA 2、SCA 3、SCA 6、SCA 7、SCA 17、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症)、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症の総称です。ポリグルタミン病の各疾患の原因遺伝子内では、CAG配列の繰り返し(CAGリピート)回数が健常人よりも増えています。このCAG配列はグルタミンというアミノ酸を作るため、原因遺伝子産物である蛋白質の中に健常人よりも長いグルタミン鎖が挿入された、ポリグルタミン蛋白質が生成されます。このポリグルタミン蛋白質は神経細胞に蓄積すると細胞の機能を低下させ、神経細胞を脱落させることが知られています。
 ポリグルタミン病のうち家族性脊髄小脳変性症は、小脳や脊髄などの神経細胞が変性・脱落して、歩行時のふらつき(運動失調)などの様々な神経症状が徐々に進行する疾患です。本研究では、ポリグルタミン病のうち世界的にも頻度が高く、わが国の家族性脊髄小脳変性症のうち約30%を占めるマシャド・ジョセフ病(SCA3)をターゲットとしました。SCA3は、原因遺伝子であるAtaxin 3 内にあるCAGリピートの異常伸長により引き起こされることが知られています。そこで、Ataxin 3内のCAG リピートを異常伸長させた疾患原因遺伝子(図2、Ataxin 3-120Q)を合成し、遺伝子を細胞内へ運ぶウイルスベクターを介して、マーモセット受精卵へ遺伝子導入を行いました。
 その結果、7頭の産仔が得られ、7頭全てにおいて変異遺伝子の導入が確認されました(図3)。このうち3頭において発症が確認され、発症に伴い、体重・握力・日内活動量の低下が認められました(図4)。また、運動失調の直接的原因となる小脳の細胞の異常(プルキンエ細胞の脱落)(図5)、頭部MRIでの第四脳室の拡大(図6)など、ポリグルタミン病の患者さんとよく似た病態も多く認められました。さらに、ヒトのポリグルタミン病に特徴的な脳病変である、ポリグルタミン蛋白質が蓄積して形成される封入体が、モデルマーモセットの脳内の神経細胞において確認されました(図7)。
 これらの結果から、今回作出された遺伝子改変マーモセットがポリグルタミン病の患者さんとよく似た病態を示すことが明らかになりました。   
 

<研究の内容2:遺伝子改変コモンマーモセットの系統化に成功>
 ヒトの疾患に対する新たな診断法や治療法を開発するための橋渡し研究を行うためには、その疾患のモデルとなる実験動物の個体が複数必要であり、かつ、異なる個体どうしが同様の病態を示すことが望まれます。例えば、治療法の開発にあたっては、治療を行った群と行わなかった群の比較や、異なる個体で同程度の治療効果が認められるかという再現性の確認、治療群において副作用がないかなどについて、同様の病態を示す複数の個体を用いて調べる必要があるからです。
 今回作出された遺伝子改変マーモセットモデルを将来の橋渡し研究に向けて実用化するためには、遺伝子改変技術で生まれた個体(第一世代)の子孫(第二世代)を作出し、系統化することが必要になります。第二世代の個体どうしは、第一世代の個体どうしよりもより近似した病態を示すことが知られています。NCNPでは、第一世代のうち、発症が確認された個体の精子を凍結保存し、顕微授精によって作出した受精卵を他のマーモセットの子宮に移植することにより、産仔の作出を試みました。その結果、現在までに5頭の産仔(第二世代)を獲得し、5頭全てにAtaxin 3遺伝子が確認されました。このことから、ポリグルタミン病モデルマーモセットの次世代作出が可能なことが証明されました。   


<期待されること>
 今回の研究によって、ポリグルタミン病に特徴的な症状や脳病変を再現した遺伝子改変モデルマーモセットの系統が世界に先駆けて作出されました。今後、このモデルマーモセットを用いた橋渡し研究を通じて、ポリグルタミン病や神経変性疾患に関する研究が進むことが期待されます。新たな治療法の開発にむけた研究だけでなく、病態の診断に有用なバイオマーカーや画像診断法を開発するための研究への応用も可能です。NCNP及び世界中の研究機関においてポリグルタミン病や神経変性疾患の病態や治療法に関する研究が進み、一日でも早く、同疾患に対する根本的な治療方法が確立することが期待されます。


<参考図>


図1
図1:コモンマーモセット(野生型)。

図2
図2:今回の研究で作成された疾患原因遺伝子の設計図。

 

図3
図3:第一世代として誕生した7頭の産仔(PQD1~7)に
疾患原因遺伝子が導入されていたことを示す実験結果。

 

図4
図4:疾患モデルマーモセットにおける体重(左)、握力(中)、日内活動量(右)の低下。対照群のマーモセット(5頭)と、発症が確認された疾患モデルマーモセット(3頭)との比較。グラフ内の横棒は各群の平均値。
 

 

図5
図5:疾患モデルマーモセットにおける小脳プルキンエ細胞の脱落。 対照群のマーモセットの小脳(右)ではプルキンエ細胞(オレンジ色に染色された細胞)が整然と並んでいるが、疾患モデルマーモセットの小脳ではほぼすべてのプルキンエ細胞が脱落している(左、矢頭)。
 

図6
図6:疾患モデルマーモセットの頭部MRIでみられた第四脳室(矢印)の拡大。
患者さんの頭部MRIでは、小脳やその周囲の脳部位の萎縮を反映して、
第四脳室の拡大が見られることが知られている。

 

図7
図7:疾患モデルマーモセットの神経細胞において確認された、
ポリグルタミン蛋白質が蓄積して形成される封入体
(右下囲み枠は拡大図、矢頭が封入体)。


 

 

 

 

Nerve-specific input modulation to spinal neurons during a motor task in the monkey.

Joachim ConfaisGeehee KimSaeka TomatsuTomohiko Takei, Kazuhiko Seki

掲載誌:Journal of Neuroscience Published 3 February 2017 Vol.37 no. 10

DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2561-16.2017

 

<研究の背景と経緯>
 全く同じ刺激が手足の皮膚などに与えられたとしても、引き起こされる感覚は状況に応じて異なることは私たちが日常生活の中で体験していることです。例えば、熱いフライパンのふたを持ち上げる場合、もし、「ふたが熱い」ということを知らない場合は皮膚刺激が脊髄の神経を興奮させ、手を引っ込める反射(屈曲反射)が起こり目的は達成できません。一方、熱いことをあらかじめ知っている場合には、神経の興奮を抑制することができます(図1)。
 このような、状況に依存した感覚反応の抑制は自己の運動中に顕著であることが、心理学的研究から明らかにされてきました。このことを示す別のケースは、手のひらをくすぐる際にも存在します。例えば、他人に手のひらをくすぐられる場合と自分自身でくすぐる場合とでは、自分自身でくすぐった方が「くすぐったさ」が抑制されること、また自分自身でくすぐった場合でも、より早く皮膚を刺激した方が感覚の抑制が大きいことなどが知られていました。また、統合失調症の患者ではこの抑制が少ない(自分がやっても他人がやっても同じように感じる)ことから病態の診断への応用を検討する研究例もあります。しかしながら、こうした研究が進められている一方で、自分の運動中に末梢感覚が変化する現象をひきおこす、脳内の仕組みは分かっていませんでした。
  

<研究の内容>
 研究グループでは、皮膚感覚を伝える末梢神経がまず脊髄で中継されることに注目し、サルが手首を動かしている最中に、手指の皮膚及び筋の感覚神経を直接電気刺激する方法を開発しました(図2)。そして、その電気刺激を用いて皮膚と筋感覚に関わる脊髄神経の反応を記録することに世界で初めて成功しました(図3)。そして、まず皮膚神経に対する脊髄神経の反応を調べると、予想通り運動中に減弱している事がわかりました(図4右、図中青矢印(ー))。この現象は、既に知られている「感覚ゲーティング」つまり、自己の運動中に、その運動によって生じる感覚が抑制される現象を反映していると考えられました。ところが、同じように筋神経への反応を見てみると、皮膚神経反応のように抑制されておらず、逆に促進していました(図4左、図中赤矢印(+))。この反応は通常の感覚ゲーティングの考え方と逆であり、新たな発見でした。
 この結果は、「感覚ゲーティング」のメカニズムに新たな解釈を与える重要な知見です。 つまり脳による感覚ゲーティングはこれまで考えられていたより、繊細に細かなコントロールによっていることが明らかになりました。そして、今回の実験結果から行動中にすべての感覚が一様に抑制されるのではなく、その行動にとって重要性の高い感覚は逆に強調され、重要性の低い感覚のみが抑制されているという新たな仮説を導くことができました。  


<今後の展開>
 本研究によって、「感覚ゲーティング」の神経メカニズムが明らかになりました。そして、運動中における感覚ゲーティングは一様でなく、重要な感覚を抽出、そうでない感覚を抑制するという、よりきめ細かなコントロールが脳によってなされていることがわかりました。今後は、感覚抑制と抽出、両者の背景にある分子レベルの仕組みを調べる研究が盛んになると予想されます。また、例えば統合失調症など精神疾患の患者さんの一部はこの感覚ゲーティングに異常があることが知られ、それが自他混同などの病態の背景にあるとする考えがありました。しかし、今回脳によるよりきめ細かな感覚ゲーティングメカニズムが明らかになったことにより、今後は臨床現場でもより細かな基準で感覚ゲーティングを測定することにより、現在より高精度な診断を行うことができる可能性があります。今後は、さまざまな運動や運動疾患において同様の計測を行うことにより、感覚ゲーティングのより詳細な行動制御における役割が明らかにされることが期待されます。


<参考図>

図1
図1 同一の感覚入力は状況に応じて異なった結果を生む(例)

熱いフライパンのふたを持ち上げなくてはならない場合。もし、「ふたが熱い」ということを知らない場合は皮膚刺激が脊髄の神経を興奮させ、手を引っ込める反射(屈曲反射)が起こり目的は達成できない(上)。一方、熱いことをあらかじめ知っている場合には、神経の興奮を抑制し反射を止めることができる(下)。
 

図2
図2 皮膚神経と筋神経からの感覚神経を選択的に刺激する新技術開発

サルの手指の皮膚神経(図中オレンジ)と筋神経(図中紫)へ電極を埋込み、慢性的に感覚神経を刺激する実験手法を開発した。それによって、サルの行動中に筋感覚及び皮膚感覚神経活動に対する脊髄神経細胞の活動を記録することが初めて可能になった。
 

図3
図3 覚醒行動下のサル脊髄細胞の末梢神経刺激に対する反応を記録する

サルの末梢神経を電気刺激し、脊髄上電位(図中上)及び脊髄細胞反応(図中下)を記録する実験技術を開発した。脊髄に刺激が到達した時間(点線)から脊髄細胞の反応開始時間(図中ヒストグラム)の時間によって、この脊髄細胞が末梢神経から直接入力を受ける細胞であると判断できる。
 

図4
図4 手の運動中に皮膚感覚と筋感覚は異なった制御を受ける

サルが手首を(1)安静、(2)運動準備、(3)手首運動、(4)力維持、(5)脱力している際に、筋神経(左)及び皮膚神経(右)を刺激した際の脊髄細胞の反応。皮膚神経を刺激すると、安静時には大きな反応(ヒストグラムのピーク)が認められるが、運動中にはこのピークが消失する(予想された反応:従来の感覚ゲーティング:青ー)。しかし、筋神経を刺激した場合は、逆に反応が大きくなった(予想外の反応:赤+)。感覚ゲーティングは対象とする感覚の種類によって柔軟にコントロールされていることが明らかになった。

 

 

 

 

 

Muscle afferent excitability testing in spinal root-intact rats: Dissociating peripheral afferent and efferent volleys generated by intraspinal microstimulation.

Saeka Tomatsu*, Geehee Kim*, Joachim Confais, Kazuhiko Seki

Journal of Neurophysiology Published 14 December 2016 Vol.36 no.50 , DOI: 10.1152/jn.00874.2016

*同等の貢献度

 

末梢の感覚情報は求心性繊維を通じて脊髄に入力する.感覚繊維の末端は脊髄内でシナプスを形成して感覚情報を伝えるが,文脈に応じたシナプス前抑制が,情報の伝達を遮断することが知られている.感覚神経末端でのシナプス前抑制の研究には,脊髄内微小電気刺激によって引き起こされる感覚神経上の電位変化を観察することが有用で,皮膚感覚入力が随意運動中のシナプス前抑制によって低下することが,この技術を用いてすでに明らかにされている(Seki et al. 2003).ところが,求心性繊維のみが束になっている皮膚神経とは異なり,筋神経は筋の状態を伝える求心性繊維と,筋を収縮させる指令を送る運動ニューロンの軸索(遠心性繊維)が束になっているため,脊髄内電気刺激による電位変化がどちらの繊維由来であるかを判別する方法が求められていた.
 本研究では求心性繊維もしくは遠心性繊維を選択的に切断した実験系(図A)において,脊髄内電気刺激を2発続けて行ない,刺激間隔が2 msのときに経路による反応の違いが大きいことを見いだした(図A,B).具体的には,求心性繊維由来の反応の場合は,2発目の振幅がやや大きくなり,遠心性繊維由来の反応の場合は2発目の振幅が小さくなる.これは,遠心性繊維由来の反応には運動ニューロンの興奮が介在するため,刺激間隔が短いと不応期があらわれることによると考えられる.さらに神経切断をしない実験において,2発目の振幅が1発目の振幅の95.3%より大きいときに求心性繊維由来,小さいときに遠心性繊維由来と分けると,シナプス前抑制の有無と関連が深いことがわかった(図C).
 この基準を用いると,神経切断をせずに筋神経に対するシナプス前抑制の研究を行なうことができる.今後の研究により,我々動物が自然な随意運動を行なうとき,どのように筋感覚入力を利用するのかに関して新たな知見を得ることができると期待される.

 

 

 

 

 

 

 

Electrophysiological identification of Macaca cortical area 3a and 3b

H. Yamada, H. Yaguchi, S. Tomatsu, T. Takei, T. Oya, K. Seki :Representation of afferent signals from forearm muscle and cutaneous nerves in the primary somatosensory cortex of the macaque monkey. Plos One, 4 Oct 2016. より

 

図C,Dに示されるように、麻酔下のマカクサルの一次感覚野(中心後回)を表層から深層に向かって微小電極で記録し、筋(DR)及び皮膚(SR)神経刺激で誘発される局所フィールド電位を記録した。解剖学的に同定されたArea 3a (図CにおけるAのポイント)からは、筋刺激によって、またArea 3b (図CにおけるBのポイント)からは皮膚刺激によってそれぞれ有意な局所フィールド電位が確認された。この事は、両領域を電気生理学的方法を用いて短時間 で即時的に区別する事が可能なことを示している。

 

 

 

 
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