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プレスリリース詳細

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平成27年6月11日
国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター(NCNP)
TEL:042-341-2711(広報係)

筋ジストロフィーに対する画期的な核酸医薬品開発につながる発見

-アンチセンス核酸のミセル化ナノ粒子は、
マクロファージ・スカベンジャー受容体を介したエンドサイトーシスにより
筋細胞に取り込まれることを報告

-研究成果を米国化学会誌Nano Lettersに発表-

国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター(NCNP、東京都小平市:樋口輝彦理事長)神経研究所遺伝子疾患治療研究部(武田伸一 研究所所長/部長併任)の青木吉嗣室長らは、両親媒性 (amphiphilic) の新世代ペプチド付加モルフォリノ核酸はミセル化粒子を形成することにより、マクロファージ・スカベンジャー受容体を介して筋細胞に取り込まれることを解明しました。本成果は、細胞膜透過性に優れた核酸医薬品を設計する際には、アンチセンス核酸の自発的なミセル化ナノ粒子形成能を考慮する(パーティクル・ラッピングモデル)ことが大変重要であることを強く示唆しています。また、マクロファージ・スカベンジャー受容体を標的にした新しいアンチセンス核酸のデリバリー法の開発にも応用可能です。本成果は、当センターで治験を実施中の、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを対象にしたエクソン53スキップの治療効果向上にも応用できる可能性があります。本研究は、オックスフォード大学のカリム・エザット博士およびマシュー・ウッド教授らとの共同研究として、金原一郎記念医学医療振興財団および英国医学研究会議などの支援によって行なわれたもので、研究成果は6月4日(米国時間)に『Nano Letters』オンライン版に掲載されました。
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.5b00490

■研究の背景

デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、全世界の出生男児3500人のうち1人の割合で発症する重篤な遺伝性筋疾患です。現在、これまでステロイド剤以外の治療法がほとんどなかった同疾患を対象に、モルフォリノ核酸を用いた“エクソン・スキップ治療”の開発が大変有望視されています。遺伝子疾患治療研究部(武田伸一部長)では、国産初のアンチセンス核酸医薬品の開発を目指して、モルフォリノ核酸のエクソン・スキップの誘導効果と安全性を、同疾患のマウスおよび犬モデルを用いて実証してきました(Annals of Neurology 2009, Molecular Therapy 2010, PLoS One 2010, PNAS 2012, Human Molecular Genetics 2013,Mol Ther Nucleic Acids. 2015)。これらの成果を受けて、DMD患者さんを対象にしたエクソン53スキップの早期探索的臨床試験が、世界に先駆け国立精神・神経医療研究センター病院で実施され、DMD患者さんにおいて本剤の治療効果を予測するジストロフィンタンパク質の発現を確認することに成功しました( http://www.ncnp.go.jp/tmc/pressrelease_03.html )。この有望な結果を受けて、エクソン53スキップの次相治験が実施される予定です。しかしながら、モルフォリノ核酸を用いたエクソン・スキップ治療の現在の課題は、優れた核酸デリバリー法がないために、心筋の治療効果が乏しく、さらに複数のエクソンを同時にスキップさせるマルチエクソンスキップ法への応用が困難な事でした。

■研究の内容

研究グループは、ケンブリッジ大学分子生物学研究所のゲイト研究室の協力を得て、モルフォリノ核酸と比べて骨格筋と心筋への核酸デリバリー能が著しく高いペプチド付加モルフォリノ核酸(PPMO)の開発を行うことに成功しました。次に、PPMOは核酸分子内に親水性部分と疎水性部分とをあわせもつ両親媒性物質 (amphiphilic molecule)であり、PBSバッファー、ウシ胎児血清あるいはアルブミンを含む細胞培養液中で、一定のPPMO濃度以上になると、直径20-50ナノメートル程度のミセル化ナノ粒子を自発的に形成することを発見しました(図1)。次に、マウス由来C2C12あるいはH2K-mdx筋細胞へのPPMOの取り込みは、マクロファージ・スカベンジャー受容体(SR-A)阻害剤により有意に低下することを明らかにしました(図2)。また、SR-AとPPMOは細胞質中で共局在すること、低温下(4度)ではPPMOの筋細胞への取り込みは有意に阻害されることがわかりました。さらに、SR-Aノックアウトマウスを対象にPPMOを経静脈全身投与したところ、特に心筋と横隔膜におけるエクソン・スキップの誘導効率が有意に低下することがわかりました。最後に、局在表面プラズモン共鳴法によりPPMOは、臨床応用が検討されている2'-O-メチル修飾リボース、トリシクロDNAアンチセンス核酸と比べて、SR-Aとの分子間結合能が高い事を示しました(図3)。以上より、PPMOのミセル化ナノ粒子はSR-Aを介したエンドサイトーシスにより筋細胞に取り込まれる事が判明しました。更なる解析により、SR-Aのサブタイプ受容体のうちSCARA1、SCARA3、SCARA5はヘテロ多量体シグナロソームを形成し、PPMOの筋細胞への取り込みに関与していることが明らかになりつつあります(図4)。

本成果は、細胞膜透過性に優れた両親媒性の核酸医薬品を開発する際には、Freund博士らが提唱したパーティクル・ラッピングモデル(PNAS, 2005)に基づき、アンチセンス核酸の自発的なミセル化ナノ粒子形成能を考慮することが大変重要であることを意味します。また、SR-Aを標的にした新しいアンチセンス核酸を設計できれば、骨格筋に加えて、心筋と横隔膜も効果的に治療可能な、画期的な核酸医薬品の開発につながると考えられます。

■今後の展開

本研究は、両親媒性アンチセンス核酸の設計法に画期的な変化をもたらすものであり、将来的に薬物デリバリー能を大幅に改善させた核酸医薬品の開発につながり、DMDを対象にした治療法開発が加速することが期待されます。さらに、DMD以外の筋疾患を対象にした核酸医薬品を用いた治療法開発の基盤研究に大いに寄与すると考えられます。本研究は、金原一郎記念医学医療振興財団および英国医学研究会議による研究資金により行われました。

原著論文情報

Ahmed K*, AOKI Yoshitsugu*, et al. Self-assembly into nanoparticles is essential for receptor mediated uptake of therapeutic antisense oligonucleotides. Nano Letters. 2015 Jun 4. [Epub ahead of print]
*共同筆頭著者

図1. PPMOは一定濃度以上でミセル化ナノ粒子を形成する。A. PPMOの透過型電子顕微鏡像。PPMO/PBS溶液の最終濃度は1 mM。直径20-50ナノメートル程度のミセル化ナノ粒子を確認できる。B. PPMOの臨界ミセル濃度(critical micelle concentration: CMC)。エオシンY (最終濃度0.019 mM)を用いて542 nmでの吸光度を測定した。

図1

図2. マウスC2C12筋細胞へのPPMOの取り込みはSR阻害剤により阻害される。マウスC2C12筋管(分化開始2日目)を50 µg/mlのフコイジン(SR阻害剤)/コンドロイチン(コントロール)で1時間培養後、培地にPPMO(最終濃度500 nM)を加えて4時間培養した。新しい分化培地に交換後、2日間培養し、細胞を回収してRT-PCRを行った。

図2

図3. PPMOはSR-A受容体との分子間結合能が高い。局在表面プラズモン共鳴法により、SR-A受容体とPPMO、2'-O-メチル修飾リボース (2'OMe)、トリシクロDNA (TcDNA)アンチセンス核酸との結合能を局在表面プラズモン共鳴法により評価した。

図3

図4. 筋細胞膜に存在するSR-Aを介したPPMOミセル化ナノ粒子の取り込み(パーティクル・ラッピングモデル)。SR-Aのサブタイプ受容体のうちSCARA1(赤)、SCARA3(黄)、SCARA5(緑)はヘテロ多量体シグナロソームを形成し、PPMOの筋細胞への取り込みに関与する可能性が高い。PPMOの単分子径は5 nm、PPMOミセル化ナノ粒子の直径は40 nmと想定した。

図4

■用語の説明

デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD)

DMDは、男児に発症する、もっとも頻度の高い遺伝性筋疾患で、ジストロフィンと呼ばれる筋肉の細胞の骨組みを作るタンパク質(ジストロフィンタンパク質)の遺伝子に変異が起こることで、正常なタンパク質が作れなくなり、筋力が低下してやがて死に至る重篤な疾患です。現在、その進行を遅らせる目的でステロイド剤による治療が行なわれていますが、それ以外に有力な治療法は存在せず、新たな治療法の開発が必要とされています。

「エクソン・スキップ治療」は、アンチセンス核酸と呼ばれる短い合成核酸を用いて、遺伝子の転写産物(メッセンジャーRNA)のうち、タンパク質に翻訳される領域(エクソン)の一部を人為的に取り除く(スキップする)ことで、アミノ酸読み取り枠のずれを修正する治療法です。正常なジストロフィンタンパク質に比べると、その一部が短縮するものの、機能を保ったジストロフィンタンパク質が発現し、筋機能の改善が期待できます。

核酸医薬品とエクソン・スキップ治療

核酸医薬品は、遺伝子の構成成分であるDNA核酸と似た構造を持ち、疾患の原因になる遺伝子を標的とする薬剤です。その遺伝子から作られるタンパク質の産生を止める、又は調節することで効果を発揮します。従来の低分子医薬品では難しかった様々な疾患の治療が可能になると期待されており、特異性が高く安全性の面にも優れることから、次世代の医薬品として注目されています。

ペプチド付加モルフォリノ核酸 (PPMO)

モルフォリノ環構造を持ち、約20〜30 塩基対の短い一本鎖からなるDNA類似のモルフォリノ核酸に細胞膜透過ペプチド(アルギニン)を付加した次世代のアンチセンス核酸です。PPMOは陽性電荷を持ち、電気的中性のモルフォリノ核酸と比べて筋肉への薬物送達能は10倍以上高いことが報告されています。

マクロファージ・スカベンジャー受容体 (SR-A)

スカベンジャー受容体(SR)は少なくとも6種類(クラスA-F)が区別されています。SR-A はマクロファージの細胞表面などに発現しており,酸化あるいはアセチル化された変性LDLコレステロールの除去、アポトーシス細胞の除去,細菌などからの生体防御,細胞接着,細胞内シグナル伝達など幅広い生理機能を持ちます。最近では粥状動脈硬化の発症機構との関連で注目されています。SR-Aは、さらにSCARA1 (SR-A1)、SCARA2、SCARA3、SCARA4、SCARA5のサブタイプに部類されます。

ミセルと臨界ミセル濃度 (CMC)

分子内に親水性部分と疎水性部分とをあわせもつ物質を両親媒性物質と呼び,界面活性剤はその典型的なものです。このような物質を水に溶かすと,ある濃度以上で,親水基を外に疎水基を内に向けて,数十から百数十分子が集まって,直径数十nmのミセルと呼ばれる会合体を形成します。このミセル形成に必要な最小濃度が臨界ミセル濃度(critical micelle concentration: CMC)です。

お問い合わせ先

〈研究に関すること〉
青木吉嗣(あおき よしつぐ)
国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター 神経研究所
遺伝子疾患治療研究部 室長
TEL: 042-346-1720
FAX: 042-346-1750
Email:

〈報道に関すること〉
国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター 広報係
〒187-8551 東京都小平市小川東町4-1-1
Tel : 042-341-2711 Fax:042-344-6745

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