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2016年12月28日
国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター(NCNP)

デュシェンヌ型筋ジストロフィーの新しい診断と治療として
エクソソーム中の筋肉特異的microRNAsが有効であることを発見

  

 国立研究開発法人 国立精神・神経医療研究センター(NCNP、東京都小平市,理事長: 水澤英洋)神経研究所(所長:武田伸一)ラジオアイソトープ管理室 橋戸和夫室長、松坂恭成研究員らの研究グループは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー (Duchenne muscular dystrophy; DMD) の病態メカニズムに、エクソソーム中の複数の筋特異的microRNAが関与することを発見しました。さらにエクソソームの放出制御が筋ジストロフィーの筋損傷の症状軽減に結びつくことも新たに示しました。DMDは、ジストロフィンタンパク質の欠損を原因とする進行性の筋変性疾患で最終的には呼吸器および心臓機能の障害により死に至る疾患ですが、現在までのところ根本的な治療法の確立はされていません。我々研究グループは2011年に、DMD患者の血清において、3つの筋特異的microRNAs (myomiRs; miR-1, miR-133a, miR-206) が健常者と比べて統計学的有意に上昇していることを報告しました。しかしながら、これらのmyomiRsのDMD病態における関与については現在までのところ明らかにされていませんでした。
 今回、本研究グループは、DMD患者とモデルマウスで上記のmyomiRsレベルがエクソソーム中で対照群と比べて統計学的有意に増加していることを明らかにしました。さらに、上記のmyomiRsのなかでmiR-133aが筋細胞の生存効果に重要な働きをしていることを明らかにしました。驚いたことに、モデルマウスにおけるエクソソームの細胞外放出を抑制することによって、血清中のmyomiRsレベルだけでなく損傷マーカーであるクレアチンキナーゼ (CK) 活性が統計学的有意に低下し筋損傷が軽減されることを観察しました。NCNPが中心となって長年に渡り、筋ジストロフィーの新規治療法開発に取り組む中で、本研究の結果は、エクソソームを仲介したmicroRNAsのDMDに対する新しい診断方法および治療法確立への応用が期待されます。

この研究成果は、日本時間2016年12月16日にPLOS ONEオンライン版に掲載されました。

本研究は、国立精神・神経医療研究センター 精神・神経疾患研究開発費
「ジストロフィン欠損モデル動物を基盤とした筋ジストロフィーの新しい治療法開発」によって行われました。  


■NCNPと筋ジストロフィー研究の取り組み
 NCNPが長年取り組んできたデュシェンヌ型筋ジストロフィーの医療と研究から、アンチセンス拡酸医薬品である“エクソン53スキップ薬”を開発し医師主導治験を実施しています。これらの成果の背景には患者登録制度Remudyや臨床試験ネットワーク形成の構築があります。そのほか、世界有数規模の筋バイオリソースを保有し、筋病理診断サービスの中心を担ってきており、筋疾患克服のためにNCNPが一体となって最先端の研究と医療を提供しています。  


■研究の背景
過剰なmyomiRsの放出がDMD病態の要因の一部ではないかと仮定

 デュシェンヌ型筋ジストロフィー (Duchenne Muscular Dystrophy ; DMD) は、新生男児約3,500人に1人の割合で罹患する進行性の筋変性疾患であり、X染色体上に存在するジストロフィン遺伝子の突然変異によるジストロフィンタンパク質の欠損が原因であることが知られています。この疾患は、約2〜5歳時に筋力の低下として初症状が確認され、その後歩行能力の低下、横隔膜および心筋の変性による呼吸器不全および心不全によって死に至ります。DMDの診断には一般的に筋損傷のマーカーである血清中のクレアチンキナーゼ活性が用いられますが、激しい運動などによる擬陽性が観察される問題点があり、新たな診断方法さらには治療法の確立が必要とされています。
  一般的に、約21-24ヌクレオチドの非翻訳一本鎖RNAであるmicroRNAsは細胞質に局在し、標的となるmRNAの非翻訳領域との結合によって標的mRNAの転写および翻訳を制御しています。このmicroRNAsの一部は、エクソソームなどの細胞内小胞体に包括された形あるいはRNA結合タンパク質やリポタンパク質との複合体を形成し血液中に放出されるため、血液中で安定な形で存在しています。我々のグループでは以前に、DMD患者の血清におけるmicroRNAsの網羅的発現解析によって、3つの筋肉特異的microRNAs (myomiRs :miR-1, miR-133a, miR-206) が健常者と比べて統計学的有意に上昇していることを報告しました*参考文献(1)。これらのmyomiRsは、DMDモデルマウス(mdx)において、ジストロフィンタンパク質の回復によって血清中のレベルが統計学的有意に低下し、さらにはDMD患者の運動能力とも相関することから*参考文献(2)、DMDに対する新規の診断マーカーとして新たに注目されています。また、上記のmyomiRsは細胞内において筋芽細胞の増殖、分化、生存などに重要な役割を果たすカスパーゼなどを含む遺伝子の発現調節を行なっていることが報告されています*参考文献(3)。本研究グループはさらに、1)miR-1およびmiR-133aの発現レベルは野生型のマウスと比べてmdxマウスの筋組織において減少していること、2)損傷筋における局所的なmyomiRsの投与が筋再生を促進すること*参考文献(4) 、miR-133aの機能欠損マウスが筋障害を起こ*参考文献(5)すから、筋細胞からの過剰なmyomiRsの放出がDMD病態の一部ではないかと仮定しました。
 また、エクソソーム中のmicroRNAsの細胞外への分泌は、neutral sphingomyelinase 2/ sphingomyelin phosphodiesterase 3 (nSMase2/SMPD3) による細胞膜に存在するスフィンゴミエリンからのセラミド形成によって制御されていることが報告されていましたが*参考文献(6)、エクソソーム中に含まれ細胞外に分泌される分泌型microRNAsとDMD病態との関連性については明らかにされていませんでした。  


■研究の内容
エクソソーム阻害剤による筋損傷の回復とエクソソームを仲介したmiR-133aの細胞生存効果を発見

 本研究グループは、DMD患者の筋細胞からの過剰なmyomiRsの分泌がDMD病態の一端を担っていると仮定して、エクソソームを仲介した分泌型myomiRsの分泌抑制によるDMD病態への治療的効果の検討を行いました。まず、エクソソーム合成酵素の阻害剤 (GW4869) をDMDモデルマウス(mdx)に5日間および10日間連続腹腔内投与を行ないました。その結果、血清中における分泌型myomiRsのレベル(図1)およびCK活性(図2)が非投与群と比べて統計学的有意に低下することを観察し、エクソソーム合成阻害による分泌型myomiRsの細胞外分泌抑制による筋損傷の軽減効果が示唆されました。さらに、これらのマウスの前頸骨筋および横隔膜における損傷筋組織へのエバンスブルー色素 (EBD) の取込みを調べた結果、非投与群と比べてエクソソーム合成酵素の阻害剤投与群の前頸骨筋ではその取込みが統計学的有意に低下することを観察し、損傷筋組織における膜の脆弱性の低下効果が示唆されました(図3)
 また、一般的にエクソソームは細胞外分泌および細胞内取込みによって細胞間および組織間の遺伝情報の伝搬を行うことが知られていますので、エクソソームを仲介した分泌型myomiRsの筋細胞への取込みによる細胞の生存効果も検討しました。具体的には、3つのmyomiRs(miR-1, miR-133a, miR-206)をそれぞれ過剰発現させたマウス筋芽細胞 (C2C12) より抽出したエクソソームをマウス筋管細胞に添加して、無血清培地で72時間培養を行ないました。その結果、エクソソーム添加群の細胞生存率は、非添加群に比べて統計学的有意に増加することを観察しました(図4)。それだけでなく、miR-133aを過剰発現させたC2C12細胞より抽出したエクソソーム添加群の細胞生存率は、他のエクソソームの添加群と比べて統計学的有意に増加することも観察しました(図4)。このことから、分泌型miR-133aはエクソソームを仲介して細胞間を伝搬することができ、取り込まれた細胞における細胞の生存率に影響を与える可能性を新たに見出すこととなりました。  


■研究の意義と今後の展開
筋肉を中心とした全身の分子制御機構であるマイオネットワークの解明からDMD病態全体像の理解へ

 エクソソームは、核酸やタンパク質、脂質など様々な生体内分子を細胞間で伝達できる新たなコミュニケーションツールとして疾患の診断マーカーや治療法への臨床応用が注目を浴びていますが、本研究結果は、他の筋疾患においても血清中における分泌型myomiRs の上昇が観察されることも我々研究グループは報告しており*参考文献(7)、DMD病態への応用だけでなく他の筋疾患への臨床応用の発展も期待できます。このエクソソームに包括された分泌型microRNAsは血液中で安定に存在し、さらにエクソソームは生体内物質であることから安全性の面からも有用性が高く、DMDに対する新たな診断マーカーだけでなく治療法の確立への臨床応用に発展することが期待されます。そのほか、エクソソームに含まれる生体内分子群の構成および割合は、分泌される細胞の種類あるいは状態によって様々であることが知られており、機能的に異なるエクソソームの分類やDMD病態に関与する分泌型myomiRsを含むエクソソームの同定も今後期待されます。また、筋変性以外のDMD病態である精神症状や学習障害などについても、筋肉からの分泌物質を中心とした他の臓器あるいは組織間におけるネットワークであるマイオネットワークから病態解明がなされ、さらには分泌型myomiRsの標的分子の同定が、DMD病態の全体像を明らかにする試金石となると予想されます。  


■挿入図と解説追加

図1 エクソソーム合成阻害剤投与によるmdxマウス血清中のmyomiRsレベル

(図1)エクソソーム合成阻害剤投与によるmdxマウス血清中のmyomiRsレベル
GW4869投与前、5日間および10日間投与後のmdxマウスおよび野生型マウスの血清中のmyomiRsレベルが低減しました。
*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001

 

図2 エクソソーム合成阻害剤投与によるmdxマウス血清中のCK活性

(図2)エクソソーム合成阻害剤投与によるmdxマウス血清中のCK活性
GW4869投与前、5日間および10日間投与後のmdxマウスおよび野生型マウスの血清中のCK活性が低減しました。
*: P < 0.05, **: P < 0.01

 

図3 損傷筋細胞へのエバンスブルー色素 (EBD)の取込み
 

(図3)損傷筋細胞へのエバンスブルー色素 (EBD)の取込み
GW4869投与前、10日間投与後のmdxマウスの前頸骨筋 (TA)および横隔膜 (diaphragm) の全領域に対するEBD(赤)の取込率の解析の結果、前頸骨筋においてEBDの取込率が減少していることが分かります。*: P < 0.05
 

図4 エクソソームを仲介したmicroRNAsによる筋管細胞の生存効果の推移

(図4)エクソソームを仲介したmicroRNAsによる筋管細胞の生存効果の推移
miR-1, miR-133a, miR-206, miR-1/miR-133a, miR-1/miR-206, miR-133a/miR-206, miR1/miR-133a/miR-206はそれぞれ筋芽細胞(C2C12)に導入され培養後、培養上清よりエクソソームを抽出し、このエクソソームを筋管細胞に添加後、無血清培地で24,48,72時間培養を行なったときの細胞数を解析しました。miR-133aを過剰に含むエクソソームの添加群が他のエクソソームの添加群と比べて細胞の生存率が上昇していることが分かります。**: P < 0.01, ***: P < 0.001 を過剰に含むエクソソームの添加群が他のエクソソームの添加群と比べて細胞の生存率が上昇していることが分かります。**: P < 0.01, ***: P < 0.001
 

【用語解説】
microRNA

約21-24ヌクレオチドの非翻訳一本鎖RNAで、細胞質において標的mRNタンパク質に翻訳されない領域である非翻訳領域に不完全な相同性結合をすることによって、mRNAの安定性および翻訳効率を制御する。

エクソソーム
体液中(血液、尿、羊水、母乳など)で観察される直径約30-200nm程度の脂質二重膜からなる小胞で、様々なタンパク質や脂質、RNAが含まれており、細胞および組織間の情報伝達を行なっている。

mRNA
細胞の核内において遺伝子の塩基配列得を遺伝情報として一本鎖RNAに写し取ったものでこの過程を転写とよび、この一本鎖RNAは核外に運ばれリボソーム上でタンパク質を構成するアミノ酸を決定しタンパク質を生成する。このタンパク質の生成過程を翻訳と呼ぶ。

小胞体
細胞内に存在する一重の生体膜に囲まれた板状あるいは網状の小器官であり、核膜の外膜とつながっている。タンパク質の合成、プロセシング、輸送、さらにはカルシウム貯蔵器官などとして働いている。

エバンスブルー色素(EBD)
エバンスブルーはアルブミンと結合する色素であり、マウスでの静脈注射において生理的条件下では血管内に限定しているが、筋損傷などにより透過性の増大を持つ組織ではアルブミンのような小さなタンパク質が透過性になり、無傷の細胞に比べて色素の呈色が表示される。  
 

*参考文献

  (1) Hideya Mizuno, Akinori Nakamura, Yoshitsugu Aoki, Naoki Ito, Soichiro Kishi, Kazuhiro Yamamoto, Masayuki Sekiguchi, Shin'ichi Takeda, Kazuo Hashido. Identification of Muscle-Specific MicroRNAs in Serum of Muscular Dystrophy Animal Models: Promising Novel Blood-Based Markers for Muscular Dystrophy.PLOS One 2011; 6(3) e8388. doi: 10.1371/journal.pone.0018388
  (2) Davide Cacchiarelli, Ivano Legnini, Julie Martone, Valentina Cazzella, Adele D'Amico, Enrico Bertini, Irene Bozzoni. miRNAs as serum biomarkers for Duchenne muscular dystrophy. EMBO Mol Med. 2011; 3(5): 258–265. doi: 10.1002/emmm.201100133
  (3) Yasunari Matsuzaka & Kazuo Hashido. Roles of miR-1, miR-133a, and miR-206 in calcium, oxidative stress, and NO signaling involved in muscle diseases. RNA & DISEASE 2015; 2: e558. doi: 10.14800/rd.558
  (4) Tomoyuki Nakasa, Masakazu Ishikawa, Ming Shi, Hayatoshi Shibuya, Nobuo Adachi, Mitsuo Ochi. Acceleration of muscle regeneration by local injection of muscle-specific microRNAs in rat skeletal muscle injury model. J Cell Mol Med. 2010; 14(10): 2495–2505. doi: 10.1111/j.1582-4934.2009.00898.x
  (5) Ning Liu, Svetlana Bezprozvannaya,John M. Shelton, Madlyn I. Frisard,Matthew W. Hulver,Ryan P. McMillan, Yaru Wu, Kevin A. Voelker,Robert W. Grange,James A. Richardson, Rhonda Bassel-Duby, Eric N. Olson. Mice lacking microRNA 133a develop dynamin 2–dependent centronuclear myopathy. J Clin Invest. 2011;121(8):3258-68. doi: 10.1172/JCI46267.
  (6) Katarina Trajkovic, Chieh Hsu, Salvatore Chiantia, Lawrence Rajendran, Dirk Wenzel, Felix Wieland, Petra Schwille, Britta Brügger, Mikael Simons. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science. 2008;319(5867):1244-7. doi: 10.1126/science.1153124.
  (7) Yasunari Matsuzaka, Soichiro Kishi, Yoshitsugu Aoki, Hirofumi Komaki, Yasushi Oya, Shin-ichi Takeda, Kazuo Hashido. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ Health Prev Med. 19(6) :452-8. doi: 10.1007/s12199-014-0405-7.


【原著論文情報】
Yasunari Matsuzaka, Jun Tanihata, Hirofumi Komaki, Akihiko Ishiyama, Yasushi Oya, Urs Rüegg, Shin-ichi Takeda, Kazuo Hashido. Characterization and Functional Analysis of Extracellular Vesicles and Muscle-Abundant miRNAs (miR-1, miR-133a, and miR-206) in C2C12 Myocytes and mdx Mice.
著者名:松坂恭成、谷端淳、小牧宏文、石山昭彦、大矢寧、ウルス・リューエック、武田伸一、橋戸和夫
掲載誌;PLOS ONE
DOI: 10.1371/journal.pone.0167811
URL: http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0167811

 

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